Fluoreszenz basierte Methoden und neue Fluoreszenz-Farbstoffe zum Nachweis von Analyten in Lösung

Abstract

Im Rahmen dieser Arbeit wurde die seit Jahrzehnten etablierte Kapillarelektrophorese mit der relativ jungen Methode der Einzelmoleküldetektion kombiniert. Das Ziel, Analytgemische auf Einzelmolekül-Ebene elektrophoretisch aufzutrennen und zu detektieren, konnte durch den Einsatz geeigneter, geladener Fluoreszenzfarbstoffe erreicht werden. Als experimenteller Aufbau wurde dabei ein konfokales Mikroskop eingesetzt, als Anregungslichtquelle wurde eine Laserdiode verwendet. Die registrierte Fluoreszenz der Farbstoffe wurde dabei über die zeitkorrelierten Einzelphotonenzählung ausgewertet. Unter Zuhilfenahme der Kapillarelektrophorese konnten im Verlauf dieser Arbeit unterschiedliche Proben, die verschiedene Fluoreszenzfarbstoffmoleküle als Analyten enthielten, anhand ihrer Fluoreszenz nachgewiesen werden. Dabei war die erreichte Empfindlichkeit der Apparatur so hoch, dass selbst einzelne Analytmoleküle nachgewiesen und anhand ihrer Fluoreszenzabklingdauer identifiziert werden konnten. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit bestand darin, neue öllösliche Fluoreszenzfarbstoffe und -konzentrate zu entwickeln. In der Farbstoffklasse der Pyrromethene wurde eine Substanzgruppe gefunden, die durch Modifikation der Edukte zu einer sehr hohen Öllöslichkeit des Produkts führt. Neben der Darstellung höchst öllöslicher Fluoreszenzfarbstoff konnten ebenso Konzentrate auf Pyrromethen-Basis entwickelt werden. Diese Konzentrate wurden dabei so hoch konzentriert, dass deren Fluoreszenz noch bei einer Verdünnung um einen Faktor 2000 mit bloßem Auge zu erkennen waren. Für einen eventuellen kommerziellen Einsatz wurde die Synthese so optimiert, dass die Farbstoffe ohne Isolierung der Zwischenstufen hergestellt werden können. Durch die Verwendung von unterschiedlichen Pyrrol-Derivaten konnte gezeigt werden, dass eine große Anzahl an Fluoreszenzfarbstoffen durch die Pyrromethene zu erschließen sind.

In the thesis at hand a combination of capillary electrophoresis with the technique of single molecule detection is studied. In that context separation of different analyte molecules could be demonstrated on the single molecule level by using charged analyte molecules. Moreover different analytes solved in a single sample were identified by their migration time as well as by their fluorescence decay time. For this purpose fluorescent dyes were used as analyte molecules. The optical set-up based on a confocal microscope with a laser diode as excitation source. To determine the fluorescence decay time of the analyte molecules the technique of time-correlated single-photon counting was used. The achieved sensitivity of the entire set-up was high enough to detect and identify even individual molecules. In the second part of this thesis new highly oil soluble fluorescent dyes and concentrates were developed. The achieved solubility of the new fluorescent concentrates was as high, that the fluorescence of a 2,000 times diluted sample could be seen with the naked eye. For commercial purposes an optimized process could be designed so that the new compounds could be synthesized in a single vessel.