Development and optimisation of mass spectrometric techniques for the analysis of antimalarial pharmaceuticals

Abstract

Antimalarials are drugs used against malaria, an infectious disease caused by a parasite that belongs to the genius plasmodium. Drug therapy to eradicate this disease is increasingly hindered by resistance of the parasite to drugs currently in use. The drug resistance has been partly attributed to the presence of drugs with wrong or low active pharmaceutical ingredients. Thus, there is an increasing need for analytical procedures to investigate the quality of antimalarial-based pharmaceuticals. Amongst the analytical techniques, the most used to date is high performance liquid chromatography (HPLC) in the reversed-phase (RP) mode coupled to mass spectrometry (MS). However, RP-HPLC is characterised by a relatively long analysis time and a consumption of a large amount of organic solvents. In a quest to develop a fast and efficient analytical method, different mass spectrometric-based techniques are developed and optimised in this thesis. In the first section, high-temperature HPLC mass spectrometry (HT-HPLC-MS)-based technique tailored for the analysis of antimalarials is developed and optimised. HPLC at high temperature permits faster separation compared to standard conditions with a reduction in chemical waste, better chromatographic selectivity and an enhanced desolvation in the MS ionisation source. Prior to HT-HPLC-MS method development, a HT-HPLC heating system was optimised for best performance and successfully coupled to a triple quadrupole mass spectrometer via electrospray ionisation (ESI) and atmospheric pressure chemical ionisation (APCI) sources. Because of the antimalarial properties of Cinchona alkaloids, a HT-HPLC-MS method with an XBridge C18 column and ESI source was developed and optimised for their analysis. The optimised method permits the separation and detection of the four major chiral alkaloids: cinchonine, cinchonidine, quinine, and quinidine and their dihydro-derivatives: dihydrocinchonine, dihydrocinchonidine, dihydroquinine, and dihydroquinidine with reduction in analysis time and organic solvents, better chromatographic selectivity and enhanced MS ionisation efficiency. Limits of detection (LOD) in the µg L-1 range were obtained. The method was shown to be suitable in the separation and detection of Cinchona alkaloids present in a commercial sample. Also, because of the antimalarial properties of artemisinin (ART) and some of its derivatives (artesunate (AS), dihydroartemisinin (DHA), and artemether (AM)), another HT-HPLC-MS strategy with a zirconia-polybutadiene (ZrO2-PBD) column, was developed and optimised for their analysis. After optimisation, DHA, ART, and AM were detected as their ammonium adducts ([M + NH4]+) at m/z 302, 300, and 316, while AS was detected as a characteristic fragment ion at m/z 272. From evaluation of ESI and APCI sources during HT-HPLC-MS analysis, best detection sensitivity for ART and derivatives is obtained with ESI compared to APCI. LODs in the µg mL-1 range were obtained with HT-HPLC-ESI-MS. The optimised HT-HPLC-ESI-MS and HT-HPLC-ESI-MS/MS method were successfully applied in the screening of AM in commercial Coartem drug tablets. In the second section, direct MS-based methods, which use minimal sample preparation procedures and relatively small sample amounts were developed and optimised for fast screening of antimalarials. In the first part of this section, a time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) method was optimised to screen for Cinchona alkaloids including quinine (Qn). ToF-SIMS analysis of Qn provided significant fingerprint SIMS fragments, which were later used in the fast qualitative screening of Qn and related compounds in small amounts of Cinchona bark and extract. The results demonstrate for the first time the ability of ToF-SIMS to perform direct analysis and fast qualitative screening (less than 10 minutes analysis time) of Cinchona alkaloids. In the second part of this section, an analytical method involving low-temperature plasma ambient desorption/ionisation mass spectrometry (LTP-ADI-MS) was developed and optimised for rapid qualitative screening of active antimalarial pharmaceutical ingredients. The method was shown to be capable of detecting the active ingredient in antimalarial drug tablets (Coartem and Malarone) as their protonated molecular ions and other characteristic ions in less than three minutes and with minimal sample preparation. Characteristic fragment ions of target molecules were used for structural identification even in the presence of a tablet matrix.

Malariamittel sind Medikamente gegen Malaria, einer ansteckenden Erkrankung, verursacht durch Parasiten die zur Gattung Plasmodium gehörten. Eine medikamentöse Therapie zur Ausrottung dieser Krankheit wird zunehmend durch die Resistenz des Parasiten gegenüber derzeit verwendeten Medikamenten behindert. Die Arzneimittelresistenz wurde teilweise dem Verbrauch von Arzneimitteln mit falschen oder zu niedrig dosierten pharmazeutischen Wirkstoffen zugeschrieben. Daher besteht ein zunehmender Bedarf an analytischen Verfahren zur Untersuchung der Qualität von Medikamenten auf Antimalaria-Basis. Unter den analytischen Techniken ist die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) im Umkehrphasenmodus (RP), gekoppelt an die Massenspektrometrie (MS), am häufigsten verwendet worden. Die RP-HPLC ist jedoch durch eine relativ lange Analysezeit und der Verbrauch einer großen Menge an organischen Lösungsmitteln gekennzeichnet. Auf der Suche nach einer schnelleren und effizienteren Methode, wurden in dieser verschiedene Massenspektrometrie-Techniken eingesetzt. Im ersten Abschnitt wurden die Hochtemperatur-HPLC-Massenspektrometrie (HT-HPLC-MS) für die Analyse von Antimalariamitteln entwickelt und optimiert. Die HPLC bei hohen Temperaturen im Vergleich zu Standardbedingungen ermöglicht eine schnellere Trennung mit weniger chemischem Abfall, besserer chromatographischer Selektivität und verbesserter Ionisierungseffizienz. Vor der Entwicklung der HT-HPLC-MS-Methode wurde ein HT-HPLC-Heizsystem für optimale Leistung optimiert und erfolgreich mit einem Triple-Quadrupol-Massenspektrometer über Elektrospray-Ionisations-(ESI) und Chemische Ionisation bei Atmosphärendruck (APCI) gekoppelt worden. Aufgrund der Antimalaria-Eigenschaften von Cinchona-Alkaloiden wurde eine HT-HPLC-MS-Methode mit einer XBridge C18-Säule und ESI-Quelle entwickelt und für ihre Analyse optimiert. Die optimierte Methode erlaubt die Trennung und den Nachweis der vier wichtigsten chiralen Alkaloide: Cinchonin, Cinchonidin, Chinin, und Chinidin und ihre Dihydro-Derivate: Dihydrocinchonin, Dihydrocinchonidin, Dihydrochinin und Dihydrochinidin mit Verringerung der Analysezeit und organischer Lösungsmittel, bessere chromatographische Selektivität und verbesserte MS-Ionisierungseffizienz. Eine Nachweisgrenze (LOD) im µg L-1 Bereich wurde mit der Methode erreicht. Es wurde gezeigt, dass das Verfahren zur Trennung und zum Nachweis von Cinchona-Alkaloiden geeignet ist, die in kommerziellen Proben vorliegen. Aufgrund der Antimalaria-Eigenschaften von Artemisinin (ART) und einigen seiner Derivate (Artesunat (AS), Dihydroartemisinin (DHA) und Artemether (AM)) wurde eine weitere HT-HPLC-MS-Strategie mit einer Zirkonoxid-Polybutadien (ZrO2-PB) Säulen für ihre Analyse entwickelt und optimiert. Nach der Optimierung wurden DHA, ART, und AM als ihre Ammoniumaddukte ([M + NH4]+) bei m/z 302, 300 und 316 nachgewiesen, sowie AS als charakteristisches Fragmention bei m/z 272. Der Vergleich von ESI- und APCI-Quellen während der HT-HPLC-MS-Analyse, ergab die beste Nachweisempfindlichkeit für ART und Derivate mit ESI. Ein Nachweisgrenze im ?g mL-1-Bereich wird mit HT-HPLC-ESI-MS erhalten. Die optimierte HT-HPLC-ESI-MS- und HT-HPLC-ESI-MS/MS-Methode wurde erfolgreich im Screening von AM in kommerziellen Coartem-Arzneimitteltabletten eingesetzt. Im zweiten Abschnitt wurden direkte massenspektrometrische Methoden entwickelt und optimiert, die minimale Probenvorbereitung und eine relativ kleine Probenmenge für ein schnelles Screening von Antimalariamitteln verwenden. Im ersten Teil dieses Abschnitts wurde die Time-of-Flight-Sekundärionen-Massenspektrometrie (ToF-SIMS) für das Screening auf Cinchona-Alkaloide einschließlich Chinin (Qn) optimiert. Die ToF-SIMS-Analyse von Qn lieferte signifikante Fingerabdruck-SIMS-Fragmente, die später beim schnellen qualitativen Screening von Qn und verwandten Verbindungen in kleinen Mengen von Cinchona-Rinde und -Extrakten verwendet wurden. Die Ergebnisse zeigen zum ersten Mal die Fähigkeit von ToF-SIMS, eine direkte Analyse und ein schnelles qualitatives Screening (weniger als 10 Minuten Analysezeit) von Cinchona-Alkaloiden durchzuführen. Im zweiten Teil dieses Abschnitts wurde eine analytische Methode mit Niedertemperaturplasma-Desorptions/Ionisations-Massenspektrometrie (LTP-ADI-MS) entwickelt und für das schnelle qualitative Screening aktiver Arzneimittel gegen Malaria optimiert. Es wurde gezeigt, dass das Verfahren in der Lage ist, den Wirkstoff in Antimalariamittel-Tabletten (Coartem und Malarone) als deren protonierte Molekülionen und andere charakteristische Ionen in weniger als drei Minuten und mit minimaler Probenvorbereitung zu detektieren. Charakteristische Fragment-Ionen von Zielmolekülen wurden zur strukturellen Identifizierung sogar in Gegenwart der Tablettenmatrix verwendet.