Optimization and application of Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry (ToF-SIMS) for the detection of nanomaterials in tissue thin sections

Abstract

The increasing use of nanoparticle (NP)-containing products leads to an enhanced emis-sion of NP into the environment. The potential dangers associated with the exposition of organisms to these materials are barely investigated and the fate of the NP upon uptake into the body is not completely understood. One reason is the lack of suitable analytical techniques, which allow the sensitive detection of NP in tissue at high spatial resolution. Prerequisites for a reliable identification are high sensitivity, high mass resolution and high spatial resolution without the need for markers. Time-of-Flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) is promising in this regard because it allows the simultaneous detection of atomic and molecular species from sur-faces without markers. However, its potential for the detection of NP in tissue has not yet been adequately explored. In the scope of this work, a suitable ToF-SIMS method is developed and optimised for the analysis of a variety of oxidic NP in lung tissue sec-tions. The suitability of ToF-SIMS for the successful detection of nanomaterials in bio-logical tissue is demonstrated by means of correlations and cross-validations of ToF-SIMS data with the results of reference techniques. In this thesis, rat lung tissue sections, containing different kinds of nanoparticles are analysed by ToF-SIMS and compared with reference techniques. Paramagnetic Fe2O3/SiO2 (core/shell) NP (primary particle size 10-20 nm; aggregate size 190 ± 20 nm) are detected by microscopic techniques (dark-field and bright-field microscopy) and ToF-SIMS colocalizing in the tissue sections. The NP are mostly attached to alveolar wall and only marginally internalized by cells. The colocalization of ToF-SIMS signal distributions for 56Fe+ and 28Si+ proves that the core/shell structure of the particles re-mains intact in the tissue. The phosphocholine head group (C5H15NPO4+) is colocalized with tissue (CH4N+) but not with the NP indicating that lipids do not adsorb onto NP under these conditions. The distribution of fluorescence-tagged SiO2 NP (25 nm) in rat lung tissue is revealed by fluorescence microscopy and ToF-SIMS. Extremely similar signal distributions for the fluorescence tag and ToF-SIMS signals (SiO3-) are obtained. Furthermore, the distribu-tions of protein (CN-) and phosphate-based signals (PO3-) can be related to the particle distribution. Rat lung tissue sections inhomogenously laden with CeO2 NP (10-200 nm) are subjected to successive analyses by first micro X-ray fluorescence (µ-XRF) and second ToF-SIMS. This approach allows a relatively fast screening of the complete section for ele-vated Ce levels at 25 µm lateral resolution, before selecting suitable regions-of-interest for high-resolution ToF-SIMS analysis at submicrometer lateral resolution (670 nm). Ce-related signal distributions (e.g. 140Ce+, 140CeO+, 140CeO2+) are detected along tissue-related signals (K2CN+) at a mass resolution of R = 4000. Besides pre-analyses, the µ-XRF also allows a coarse cross-validation of the ToF-SIMS signal distributions. ZrO2 NP (primary sizes of 9-10 nm) are mainly detected as agglomerates in phagocytic cells by both high-spatial resolution techniques, ToF-SIMS and ion beam microscopy (IBM). Both techniques detect ZrO2 related signals at high lateral resolutions (400-600 nm for ToF-SIMS and about 1000 nm for IBM). Only small quantities of NP are found in the lung epithelium. Besides the NP-related signals, S and P signal from IBM colocalize with PO+ and SO2+ from ToF-SIMS. The presence of S-, P- and Zr-related signals in both techniques enables a cross-validation of the results. Additionally, ToF-SIMS signals indicating the distribution of certain compounds such as phospholip-ids (C4H8N+, C6H12N+, C5H15NPO4+) and amino acids (K2CN+, C2H6N+, C3H8N+) are detected at mass resolutions of up to 9000. In summary, different oxidic nanoparticle types with sizes from 9 nm to more than 200 nm are directly detected by ToF-SIMS (without the need for markers) in rat lung tissue sections. The results are confirmed by independent techniques such as bright- and dark-field microscopy, µ-XRF and IBM. The presented ToF-SIMS analyses reveal the distribution of nanoparticles at high confidence and provide further elemental and mo-lecular information from the particle-surrounding matrix (e.g. amino acids or lipid resi-dues). Lateral resolutions of 400 nm and mass resolutions of up to 9000 with the ability to acquire organic and inorganic signals simultaneously across the whole mass-range are unique features highlighting the great potential of ToF-SIMS for the detection of nano-particles in tissue. These results serve as a basis for the analysis of the fate of the nano-particles in mammalian bodies for future nanotoxicology studies.

Die steigende Anzahl der Anwendungen von Nanopartikel (NP) -haltigen Produkten führt zu einer verstärkten Emission von NP in die Umwelt. Die möglichen Gefahren, die von einer Exposition durch diese Materialien ausgehen, sind noch nicht vollständig bekannt. So ist zum Beispiel der Verbleib der NP bei einer Aufnahme in den Körper nicht vollständig verstanden. Ein Grund dafür ist der Mangel an geeigneten analytischen Techniken, die den empfindlichen Nachweis von NP im Gewebe bei hoher räumlicher Auflösung ermöglichen. Die Anforderungen für eine zuverlässige Identifikation der NP sind eine hohe Empfindlichkeit, hohe Massenauflösung und hohe räumliche Auflösung ohne die Notwendigkeit für den Einsatz von Markern. Flugzeit-Sekundärionenmassenspektrometrie (ToF-SIMS) ist für diese Anwendung eine sehr vielversprechende Methode, da diese Technik die gleichzeitige direkte Detektion von atomaren und molekularen Spezies von Oberflächen ohne den Einsatz von Markern ermöglicht. Allerdings wurde das Potenzial dieser Technik für den Nachweis von NP im Gewebe bisher nicht ausreichend untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit wird daher eine geeignete ToF-SIMS-Methode für die Analyse von oxidischen NP in Lungengewebeschnitten etabliert und optimiert. Die Eignung der ToF-SIMS für die erfolgreiche Erkennung von NP in biologischem Gewebe wird durch Korrelationen und Kreuzvalidierungen von ToF-SIMS-Daten mit den Ergebnissen von Referenztechniken demonstriert. In dieser Arbeit werden Ratten-Lungengewebeschnitte, welche unterschiedliche Typen von NP enthalten mit ToF-SIMS und Referenztechniken analysiert und die Ergebnisse gegenübergestellt. Paramagnetische Fe2O3/SiO2 (core/shell) NP mit einer Primärpartikelgröße von 10-20 nm (Aggregatgröße von 190 ± 20 nm) werden sowohl mit Hilfe von Hellfeld- und Dunkelfeldmikroskopie als auch mit ToF-SIMS untersucht. Die Signale der unterschiedlichen Techniken zeigen eine extrem ähnliche Lateralverteilung der Signale. Die Verteilung zeigt, dass die Partikel sich zumeist an den alveolaren Wänden und nur zu sehr geringen Anteilen innerhalb von Zellen wiederfinden. Die Kolokalisation der 56Fe+ und 28Si+ Signale bestätigt die Stabilität der Fe/Si Core/Shell-Struktur auch im Gewebe. Die Phosphocholin-Kopfgruppe C5H15NPO4+ liegt kolokalisiert mit dem Gewebesignal CH4N+ aber nicht mit den NP vor. Dies legt die These nahe, dass Phospholipide unter den gegebenen Bedingungen nicht an die NP adsorbieren. Die Verteilung von Fluoreszenzmarkierten SiO2 NP (25 nm) im Lungengewebe der Ratte kann durch die Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie und ToF-SIMS aufgeklärt werden. Beide Techniken zeigen extrem ähnliche Lateralverteilungen von Fluoreszenzsignalen und ToF-SIMS SiO3-Signalen. Zudem können weitere ToF-SIMS Signalverteilungen von z.B. Protein (CN-) und Phosphat-basierten Signalen der Partikelverteilung zugeordnet werden. Weiterhin wurden Rattenlungengewebeschnitte mit inhomogener Beladung von CeO2 NP (10-200 nm) nacheinander mit Mikroröntgenfluoreszenzanalyse (µ-XRF) und ToF-SIMS untersucht. Dieser Ansatz ermöglicht eine relativ schnelle Untersuchung des gesamten Gewebeschnittes auf erhöhte Ce-Level. Trotz der Lateralauflösung von 25 µm eignet sich diese Technik zur Auswahl von Untersuchungsbereichen für die folgende hochauflösende ToF-SIMS Analyse (Lateralauflösung 670 nm). Die Lateralverteilung diverser Ce-haltiger Spezies (z. B. 140Ce+, 140CeO+, 140CeO2+) zeigen insbesondere in der Nähe von Gewebe-spezifischen Signalen (K2CN+) hohe Intensitäten. Die erreichte Massenauflösung der ToF-SIMS liegt hier bei ca. R = 4000. Neben der Voranalyse von Gewebeschnitten zur Auswahl relevanter Nanopartikel-haltiger Bereiche können die Signale der µ-XRF auch für eine grobe Kreuzvalidierung der ToF-SIMS Ergebnisse dienen. ZrO2 Nanopartikel mit Primärpartikelgrößen von 9-10 nm wurden sowohl von ToF-SIMS als auch von der Ionenstrahlmikroskopie (IBM) in Form von Agglomeraten in der Nähe in phagozytischen Zellen detektiert. Dabei wurden Lateralauflösungen von 400-600 nm für die ToF-SIMS und 1000 nm für die Ionenstrahlmikroskopie erreicht. Es wurden nur geringe Mengen von Nanopartikeln im Lungenepithel detektiert. Neben den Nanopartikelsignalen (Zr; ZrO+ in ToF-SIMS) konnten auch die Verteilungen der S- und P-Signale der IBM mit der ToF-SIMS in Form von SO2+ und PO+ abgeglichen werden. Diese Kreuzvalidierung mit zwei Methoden erlaubt eine sehr hohe Sicherheit bei der Zuordnung der Signale. Mit der ToF-SIMS wurden zudem weitere Signalverteilungen gefunden, welche auf die Verteilung von bestimmten Verbindungen wie z.B. Phospholipiden (C4H8N+, C6H12N+, C5H15NPO4+) oder Aminosäuren (K2CN+, C2H6N+, C3H8N+) hindeuten. Dabei konnten Massenauflösungen von bis zu 9000 erreicht werden. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass verschiedene oxidische Nanopartikeltypen mit Größen von 9 nm bis zu mehr als 200 nm mit der ToF-SIMS ohne die Notwendigkeit von Markern im Lungengewebe von Ratten nachgewiesen werden können. Diese Ergebnisse werden durch unabhängige Techniken, wie Hell- und Dunkelfeldmikroskopie, µ-XRF und IBM bestätigt. Die vorgestellten ToF-SIMS-Analysen zeigen die Verteilung von Nanopartikeln mit einer sehr hohen Zuverlässigkeit und liefern zudem weitere Informationen über die Verteilung von anderen Elementen und Molekülen in der Umgebung der Nanopartikel (z.B. Aminosäuren oder Lipide). Lateralauflösungen von 400 nm und Massenauflösungen von bis zu 9000 zusammen mit der Fähigkeit der simultanen Erfassung von organischen und anorganischen Signale über den gesamten Massenbereich sind einzigartige Eigenschaften, welche das große Potential der ToF-SIMS für die Detektion von Nanopartikeln in Geweben hervorheben. Diese Ergebnisse legen den Grundstein für weitere zukünftige nanotoxikologische Studien zum Verbleib von Nanomaterialien im Körper von Säugetieren.