Amidopyrylium-Fluoreszenz-Farbstoffe

Abstract

Fluoreszenzbasierte Untersuchungsmethoden gewinnen aufgrund ihrer hohen Nachweisempfindlichkeit speziell in der biochemischen Analytik und medizinischen Diagnostik zunehmend an Bedeutung. Häufig werden dabei fluoreszierende Farbstoffe als so genannte Fluoreszenzsonden zur Markierung von Biomolekülen eingesetzt. Vor allem der rote Spektralbereich bietet eine Reihe von Vorteilen, so dass es sinnvoll ist, Farbstoffe zu verwenden, die oberhalb von 600 nm absorbieren und fluoreszieren. Bisher gibt es nur wenige Klassen intensiv rot fluoreszierender Farbstoffe, wie z. B. Cyanine, Oxazine, Carbopyronine und einige Xanthenderivate. 1971 wurde die erste Synthese einer neuen Klasse langwellig absorbierender Farbstoffe beschrieben. Diese amidüberbrückten Benzopyryliumfarbstoffe sind Gegenstand der vorliegenden Arbeit. Es wurde eine große Anzahl neuer Vertreter dieser Farbstoffklasse dargestellt und ihre spektralen Eigenschaften untersucht. Neben der Strukturabhängigkeit der Absorptionswellenlänge wird die Beeinflussung des Absorptions- und Fluoreszenzverhaltens durch Lösungsmittelumgebung, pH-Wert und Temperatur vorgestellt. Die Amidopyryliumfarbstoffe absorbieren zwischen 590 und 680 nm und zeigen eine besonders große Stokes-Verschiebung von zirka 50 nm. Aus experimentellen Daten kann die natürliche Lebensdauer der Amidopyryliumfarbstoffe zu 8 ns abgeschätzt werden. Bei Raumtemperatur variiert die Fluoreszenzquantenausbeute der Farbstoffe in Abhängigkeit von der Molekülstruktur zwischen 10 und 50 %. Auch die Lösungsmittelumgebung sowie Viskosität und Temperatur haben einen starken Einfluss auf die Quantenausbeute. Eine Verbesserung der Stabilität der Farbstoffe in basischem Medium konnte durch die Einführung eines Carboxyphenylsubstituenten erreicht werden, da die Entstehung einer farblosen Pseudobase verhindert wird. Es wurden außerdem Amidopyryliumfarbstoffe mit koppelbaren Carboxylgruppen dargestellt, die als Fluoreszenzsonde eingesetzt werden können.

The measurement of fluorescence has become a very useful tool in medical and biological diagnostics as well as in environmental analysis and material sciences due to the high sensitivity of fluorescence spectroscopy. Many techniques and analytical concepts use fluorescent dyes for labelling of biological compounds. It is possible to enhance the sensitivity of detection by using marker dyes that absorb and fluoresce in the red or near infrared spectral region. Only few dyes exhibiting intense red fluorescence have been known until recently, e. g. cyanines, oxazines, carbopyronins and some xanthene derivatives. A new class of fluorescent dyes for the red region of the visible spectrum is the topic of this thesis. The first synthesis of the amide-bridged benzopyrylium dyes was published in 1971. A great variety of new dyes belonging to this class of fluorescent dyes has been prepared. Their spectral properties, i. e. absorption and fluorescence, have been studied with emphasis on temperature and environmental (solvent, pH) influences. The absorption maximum of the amidopyrylium dyes occurs, depending on the molecular structure, in the region between 590 and 680 nm. A special feature of these dyes is the large Stokes shift of about 50 nm. From experimental data a natural fluorescence lifetime of about 8 ns can be expected. The quantum yield of fluorescence of the dyes varies, depending on the molecular structure, between 10 and 50 % at room temperature. The solvent, viscosity and temperature have a strong influence on the quantum yield. Amidopyrylium dyes can form a colourless pseudobase in alkaline media. It is possible to protect the reactive centre by a spacious carboxyphenyl substituent. Such dyes are stable towards base. Further it was possible to introduce coupling groups, e. g. COOH, without affecting the optical properties of the dyes. Via an active ester such dyes can be coupled easily to amino groups of proteins, nucleotides and other analyte molecules and thus can be used as long-wavelength fluorescent labels.