Synthesis of Telechelic Polymers as Functional Building Blocks in Material Science and Biomedical Applications Based on Thermoresponsive Poly(2 Oxazoline)s and N-Substituted Poly(Acrylamide)s

Abstract

Thermoresponsive and biocompatible polymers attend nowadays great attention in research areas like DNA nanotechnology, continuous monitoring of analytes in biosensing assays and gene therapy as non viral vectors. Therefore, it is crucial to design and adjust the molecular architecture of such polymers to the corresponding requirements of the targeted application, e.g., by the specific structure of the monomers, by the choice of comonomer composition, and by the introduction of functional groups within the backbone or at the chain ends. The main focus of this thesis was directed towards the synthetic development of thermoresponsive polymer systems and study of their applicability as polymer-DNA-conjugates, as biosensor matrix, and as non-viral transfection vectors. The design of polymer-DNA conjugates to achieve complex structure formation by hierarchical self-assembly with respect to responsive and reconfigurable matter combines the self-assembly pathways of block copolymers and DNA. Such conjugates allow the design of scaffolds with arbitrary and programmable shape, which can be applied e.g., as templates for the fabrication of nanoobjects with specific geometries. Thus, thermoresponsive polymer-DNA conjugates and their resulting superstructures are intensely studied in various research disciplines to understand their self-assembly mechanism. In the context of the collaboration with Dr. Emmanuel Stiakakis at the Forschungszentrum Jülich, synthetic routes based on cationic ring-opening polymerization (CROP) of 2-alkyl-2-oxazolines were developed in this thesis to obtain well-defined and thermoresponsive poly(2-oxazoline)s as co- and terpolymers carrying azide end groups. These functional end groups were introduced via 3-azidopropyl tosylate as initiator and sodium azide as termination agent. Furthermore, thermoresponsive NiPAm-based polymers were synthesized by reversible addition fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization, in which an azide-functionalized chain transfer agent was employed. A two-step post-functionalization strategy was developed, which includes the transformation of the respective azide group into an amino group by a Staudinger reduction and subsequent coupling of dibenzylcyclooctyne (DBCO)-groups via the N-hydroxysuccinimide (NHS) active ester. It was found that this efficient two-step post-functionalization strategy could be exploited for both, the poly(2 oxazoline) and the poly(NIPAm) derivatives carrying azide moieties. Efficient coupling of the azide- and DBCO-functionalized polymers with the respective azide-modified DNA derivative was demonstrated by gel electrophoresis experiments by the Stiakakis group in Jülich. These experiments showed also that the poly(2 oxazoline)s react more efficiently with the DNA than the poly(NIPAm) derivatives. The application of hetero-telechelic poly(2 oxazoline)s as flexible linkers in surface plasmon resonance (SPR) spectroscopy-based sensors are considered for the design of different biosensing assay architectures that allow continuous monitoring of small analytes. This research topic was investigated in collaboration with Dr. Jakub Dostalek at AIT in Vienna. For this purpose, well-defined, thermoresponsive and hetero-telechelic poly(2-oxazoline) copolymers were prepared by CROP, which carried an azide end group on one side for coupling to a fluorescent dye. The other chain end was modified with either an amine- or a (protected) thiol-end group for coupling to the sensor surface. Successful coupling of the thermoresponsive copolymers to the sensor surface could be demonstrated after deshielding the amine- or thiol-end groups, followed by conjugation of the fluorescent dye Alexa Fluor 647 to the azide groups. In order to mimic affinity interactions, temperature-modulated surface plasmon-enhanced fluorescence spectroscopy (SPFS) experiments were conducted with these polymer layers in the labs of the Dostalek group. A promising sensor design was identified, in which the fluorescence intensity could be reversibly switched upon modulation of the temperature. However, in all performed SPFS measurements photobleaching was observed as undesired side effect. In another research focus, a novel polymer architecture based on poly(2-oxazoline)s bearing protected thiol functionalities was investigated, which can be selectively liberated by irradiation with UV light. Whereas free thiol groups often suffer from oxidation or other spontaneous reactions that degrade polymer performance, this strategy with masked thiol groups offers the possibility of photodeprotection on demand with spatio-temporal control while maintaining the polymer integrity. In order to gain access to thiol-containing poly(2-oxazoline)s as gel precursors, a novel oxazoline monomer 2-{2-[(2-nitrobenzyl)thio]ethyl}-4,5-dihydrooxazole (NbMEtOxa) carrying a 2 nitrobenzyl-shielded thiol group was synthesized and copolymerized with 2-ethyl-2-oxazoline (EtOxa) in varying ratios. Moreover, the concept of tandem network formation was exemplarily demonstrated by using the photoinitiator 2 hydroxy-2-methylpropiophenone (HMPP) and pentaerythritol tetraacrylate (PETA), a commercially available, tetrafunctional vinyl crosslinker. The crosslinking experiments indicate that a minimal ratio of ~10% NbMEtOxa repeat units in the polymer backbone is necessary for network formation and in-situ gelation in N,N dimethylformamide. Novel non-viral polymer-based vectors in gene therapy require several attributes like biocompatibility, the ability for strong DNA complexation, and an appropriate molar mass range. Further, the balance between hydrophobic moieties and charge influences their performance. The ability for complexation and the hydrophobicity of such carriers can be adjusted e.g., by varying the spacer lengths of the side chains carrying a positive charge or the number of amino groups at the side chain ends. The size of such a carrier molecule can be tailored with controlled polymerization techniques. Therefore, a series of copolymers composed of the biocompatible (2-hydroxyethyl) acrylamide (HEAm) and one of four different masked amino-functionalized acrylamides with different side chain lengths were prepared by RAFT polymerization with a targeted ratio of 30% side chains containing amino group. After removal of the amino protecting groups, the copolymers were scrutinized in in vitro experiments with different cell lines and compared to polyethyleneimine (PEI) as commonly adopted reference. The cell experiments were performed in collaboration with Dr. Tony Le Gall in the laboratories at the Université de Bretagne Occidentale in Brest. These studies demonstrated that the specifically synthesized polymers were tolerated by all tested cell types even at high polymer/DNA mass ratios. DNA complexation assays corroborated the ability to bind DNA for all tested polymers, in which the polymers carrying amino groups that are connected through a C12-spacer to the polymer backbone showed the best results. Further, in cell transfection experiments, the copolymers with the amino groups bound to the backbone by a C6-spacer yielded the best gene transfection efficiency. These results suggested that complexation of DNA outside of the cells and its release once inside target cells was best achieved with the latter compound under the experimental conditions explored. However, the transfection efficiency was lower compared to the gold standard polyethyleneimine (PEI).

Thermoresponsive und biokompatible Polymere erhalten heutzutage große Aufmerksamkeit in Forschungsgebieten wie DNA-Nanotechnologie, kontinuierliche Detektion von Analyten in Biosensoren und in Gentherapie als nicht-viraler Vektor. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, die molekulare Architektur solcher Polymere auf die entsprechenden Anforderungen der Zielanwendung abzustimmen, z. B. durch die spezifische Struktur der Monomere, durch die Wahl der Comonomerzusammensetzung und durch die Einführung von funktionellen Gruppen innerhalb der Kette oder an den Kettenenden. Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag dabei auf der synthetischen Entwicklung thermoresponsiver Polymersysteme und der Untersuchung ihrer Anwendbarkeit als Polymer-DNA-Konjugate, als Biosensor-Matrix und als nicht-virale Transfektionsvektoren. Das Design von Polymer-DNA-Konjugaten zur Erzielung komplexer Strukturbildung durch hierarchische Selbstorganisation in Bezug auf reaktionsfähige und rekonfigurierbare Materie kombiniert die Selbstorganisationswege von Blockcopolymeren und DNA. Solche Konjugate ermöglichen den Entwurf von Gerüsten mit beliebiger und programmierbarer Form, die z. B. als Vorlagen für die Herstellung von Nanoobjekten mit bestimmten Geometrien verwendet werden können. Dafür werden thermoresponsive Polymer-DNA-Konjugate und die daraus resultierenden Überstrukturen intensiv in verschiedenen Forschungsdisziplinen untersucht, um ihren Selbstorganisationsmechanismus zu verstehen. Im Rahmen der Zusammenarbeit mit Dr. Emmanuel Stiakakis vom Forschungszentrum Jülich wurden Synthesestrategien entwickelt, die auf der kationischen ringöffnenden Polymerisation (CROP) von 2-Alkyl-2-oxazolinen basieren, um definierte und thermoresponsive Poly(2 Oxazolin)e als Co- und Terpolymere mit Azid-Endgruppen zu erhalten. Die funktionellen Endgruppen wurden mittels 3-Azidopropyltosylat als Initiator und Natriumazid als Abbruchsreagenz eingeführt. Weiterhin wurden thermoresponsive NiPAm-basierte Polymere durch „Reversible Additions-Fragmentierungs Kettenübertragungs-Polymerisation“ (RAFT-Polymerisation) synthetisiert, bei der ein azidfunktionalisierter Kettenüberträger verwendet wurde. Es wurde eine zweistufige Postfunktionalisierungsstrategie entwickelt, die die Umwandlung der jeweiligen Azidgruppe in eine Aminogruppe durch eine Staudinger-Reduktion und die anschließende Kopplung von Dibenzylcyclooctin (DBCO)-Gruppen mittels N-Hydroxysuccinimid (NHS) Aktiv-Ester beinhaltet. Es wurde festgestellt, dass diese effiziente zweistufige Postfunktionalisierungs-strategie sowohl für die Poly(2-Oxazolin)e als auch für die Poly(NIPAm) Derivate, die Azid-Gruppen enthalten, genutzt werden kann. Die effiziente Kopplung der Azid- und DBCO-funktionalisierten Polymere mit dem jeweiligen Azid- oder DBCO-modifizierten DNA-Derivat wurde in Gelelektrophorese-Experimenten von der Stiakakis-Gruppe in Jülich nachgewiesen. Diese Experimente zeigten auch, dass die Poly(2 Oxazolin)e effizienter mit der DNA reagieren als die vergleichbaren Poly(NIPAm) Derivate. Der Einsatz von heterotelechelischen Poly(2-Oxazolin)en als flexible Linker in Oberflächen-Plasmonresonanz- (SPR) -Spektroskopie-basierten Sensoren wird für den Aufbau unterschiedlicher Sensor-Architekturen in Betracht gezogen, die eine kontinuierliche Detektion kleiner Moleküle ermöglichen. Dieses Forschungsthema wurde zusammen mit Dr. Jakub Dostálek am AIT in Wien untersucht. Zu diesem Zweck wurden durch CROP thermoresponsive und heterotelechelische Poly(2-Oxazolin) Copolymere mit definierten Molmassen hergestellt, die an einem Ende der Polymerkette eine Azidgruppe trugen, um sie an einen Fluoreszenzfarbstoff zu binden. Das andere Kettenende wurde entweder mit einer Amin- oder einer (geschützten) Thiol-Endgruppe zur Bindung an die Sensoroberfläche modifiziert. Die erfolgreiche Kupplung der thermoresponsiven Copolymere an die Sensoroberfläche konnte nach dem Entschützen der Amin- oder Thiol-Endgruppen und nach der Konjugation des Fluoreszenzfarbstoffs Alexa Fluor 647 an die Azid-Gruppen nachgewiesen werden. Um Affinitäts-Wechselwirkungen imitieren zu können, wurden mit diesen Polymerschichten Versuche zur temperaturmodulierten Oberflächenplasmon-verstärkten Fluoreszenz-spektroskopie (SPFS) in Laboren der Dostálek-Gruppe durchgeführt. Dabei wurde ein vielversprechender Sensoraufbau identifiziert, bei dem die Fluoreszenzintensität bei Modulation der Temperatur reversibel geschaltet werden konnte. Jedoch wurde in allen durchgeführten SPFS-Messungen lichtinduziertes Ausbleichen des Farbstoffes als unerwünschte Nebenwirkung beobachtet. In einem anderen Forschungsprojekt wurde eine neuartige Polymerarchitektur basierend auf Poly(2-Oxazolin)en, die Thiol-Funktionalitäten tragen, untersucht, welche durch Bestrahlung mit UV-Licht selektiv freigesetzt werden können. Während freie Thiol-Gruppen oft anfällig für Oxidation oder andere spontane Reaktionen sind, welche die Polymerleistung beeinträchtigen, bietet diese Strategie mit maskierten Thiol-Gruppen die Möglichkeit der gezielten Photoentschützung mit räumlicher und zeitlicher Kontrolle bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung der Polymerintegrität. Um Zugang zu thiolhaltigen Poly(2-oxazolin)en als Gel-Vorstufen zu erhalten, wurde das neuartige Oxazolinmonomer 2-{2-[ (2-nitrobenzyl) thio]ethyl}-4,5-dihydrooxazol (NbMEtOxa) mit einer durch 2-Nitrobenzyl-geschützten Thiol-Gruppe synthetisiert und in unterschiedlichen Comonomerverhältnissen mit 2-Ethyl-2-oxazolin (EtOxa) copolymerisiert. Darüber hinaus wurde das Konzept einer Tandem-Netzwerkbildung exemplarisch mit dem Photoinitiator 2 Hydroxy-2-methylpropiophenon (HMPP) und Pentaerythritoltetraacrylat (PETA), einem gebräuchlichen, tetrafunktionellen Vinylvernetzer, demonstriert. Die Vernetzungsexperimente zeigen, dass ein Mindestverhältnis von ~10% NbMEtOxa-Wiederholungseinheiten im Polymer-Rückgrat für die Netzwerkbildung und die In-situ-Gelierung in N,N-Dimethylformamid erforderlich ist. Neuartige, nicht-virale Polymer-basierte Vektoren in der Gentherapie erfordern mehrere Eigenschaften wie Biokompatibilität, die Fähigkeit zur starken DNA-Komplexierung und eine definierte Molmasse. Darüber hinaus beeinflusst das Gleichgewicht zwischen hydrophoben Anteilen und Ladung ihre Leistung. Die Komplexierungsfähigkeit und der hydrophobe Charakter solcher Träger können z. B. durch Variation der Spacer-Länge der positiv geladenen Seitenketten oder der Anzahl der Aminogruppen an den Seitenkettenenden eingestellt werden. Die Größe eines solchen Trägermoleküls kann mit kontrollierte Polymerisationstechniken angepasst werden. Daher wurde eine Reihe von Copolymere bestehend aus dem biokompatiblen (2-Hydroxyethyl) Acrylamid (HEAm) und einem von vier verschiedenen maskierten aminfunktionalisierten Acrylamiden mit unterschiedlichen Seitenkettenlängen durch RAFT-Polymerisation mit einer angestrebten Menge von 30% Aminogruppen mit Seitenketten synthetisiert. Nach Entschützung der Aminogruppen wurden die Copolymere in in vitro Experimenten hinsichtlich Zelltoxizität, DNA-Komplexierung und Transfektionseffizienz mit verschiedenen Zelllinien untersucht und Polyethylenimin (PEI) als Standard verglichen. Diese Zellexperimente wurden in Zusammenarbeit mit Dr. Tony Le Gall in den Laboren der Université de Bretagne Occidentale in Brest durchgeführt. Diese Studien zeigten, dass die speziell hergestellten Polymere von allen getesteten Zelltypen selbst bei hohen Polymer/DNA Massenverhältnissen toleriert wurden. DNA-Komplexierungstests zeigten eine gute Bindungsfähigkeit für alle getesteten Polymere. Insbesondere die Polymere mit Amingruppen, die über einen C12-Spacer verbunden waren, zeigten die höchste DNA-Beladung. In Zelltransfektionsexperimenten wurden unter den gegebenen experimentellen Bedingungen die beste Gentransfektionseffizienz für die Copolymere mit C6-Spacern zwischen den Aminogruppen und dem Polymer-Rückgrat gefunden. Allerdings war die Transfektionseffizienz im Vergleich zum Goldstandard Polyethylenimin (PEI) geringer.