Rapid identification and classification of food-relevant spoilage microorganisms by Raman- and IR-microspectroscopy

Abstract

Microorganisms not only contribute to the spoilage of food but can also cause illnesses through consumption. Consumer concerns and doubts about the shelf life of the products and the resulting enormous amounts of food waste have led to a demand for a rapid, robust, and non-destructive method for the detection of microorganisms, especially in the food sector. Therefore, a rapid and simple sampling method for the Raman- and infrared (IR)-microspectroscopic study of microorganisms associated with spoilage processes was developed. For subsequent evaluation pre-processing routines, as well as chemometric models for classification of spoilage microorganisms were developed. The microbiological samples are taken using a disinfectable sampling stamp and measured by microspectroscopy without the usual pre-treatments such as purification separation, washing, and centrifugation. The resulting complex multivariate data sets were pre-processed, reduced by principal component analysis, and classified by discriminant analysis. Classification of independent unlabeled test data showed that microorganisms could be classified at genus, species, and strain levels with an accuracy of 96.5 % (Raman) and 94.5 % (IR), respectively, despite large biological differences and novel sampling strategies. As bacteria are exposed to constantly changing conditions and their adaptation mechanisms may make them inaccessible to conventional measurement methods, the methods and models developed were investigated for their suitability for microorganisms exposed to stress. Compared to normal growth conditions, spectral changes in lipids, polysaccharides, nucleic acids, and proteins were observed in microorganisms exposed to stress. Models were developed to discriminate microorganisms, independent of the involvement of various stress factors and storage times. Classification of the investigated bacteria yielded accuracies of 97.6 % (Raman) and 96.6 % (IR), respectively, and a robust and meaningful model was developed to discriminate different microorganisms at the genus, species, and strain levels. The obtained results are very promising and show that the methods and models developed for the discrimination of microorganisms as well as the investigation of stress factors on microorganisms by means of Raman- and IR-microspectroscopy have the potential to be used, for example, in the food sector for the rapid determination of surface contamination.

Mikroorganismen tragen nicht nur zum Verderb von Lebensmitteln bei sondern können durch deren Verzehr auch Krankheiten auslösen. Die Verunsicherung der Konsumenten sowie die Skepsis am Mindesthaltbarkeitsdatum der Produkte und die daraus resultierenden enormen Mengen an Lebensmittelabfällen sorgen für den Wunsch nach einer schnellen, robusten und zerstörungsfreien Methode zum Nachweis von Bakterien, insbesondere im Lebensmittelsektor. Daher wurde eine schnelle und einfache Probenahmemethode für die Raman- und Infrarot (IR)-Mikrospektroskopische Untersuchung von Mikroorganismen, die mit Verderbsprozessen in Verbindung stehen, konzipiert. Zur anschließenden Auswertung wurden pre-processing Routinen sowie chemometrische Modelle zur Klassifizierung der Verderbserreger entwickelt. Mit einem desinfizierbaren Probenahmestempel werden die zu untersuchenden mikrobiologischen Proben, ohne die üblichen Vorbehandlungen wie Separation, Reinigung und Zentrifugation, entnommen und mikrospektroskopisch vermessen. Die resultierenden komplexen multivariaten Datensätze wurden durch eine Hauptkomponentenanalyse reduziert und mittels Diskriminanzanalyse klassifiziert. Die Klassifizierung unabhängiger ungelabelter Testdaten zeigt, dass Mikroorganismen trotz großer biologischer Unterschiede und neuartiger Probenahmestrategien mit einer Genauigkeit von 96,5 % (Raman) bzw. 94,5 % (IR) auf Gattungs-, Arten- und Stammebene klassifiziert werden können. Da Bakterien sich ständig wechselnden Bedingungen ausgesetzt sind und durch ihre Anpassungen so für herkömmliche Messmethoden möglicherweise nicht mehr zugänglich sind, wurden die entwickelten Methoden und Modelle auf ihre Eignung für Stress ausgesetzten Mikroorganismen untersucht. Im Vergleich zu normalen Wachstumsbedingungen wurden bei unter Stress stehenden Mikroorganismen spektrale Veränderungen in Lipiden, Polysacchariden, Nukleinsäuren und Proteinen beobachtet. Es wurden Modelle entwickelt, um die untersuchten Mikroorganismen unabhängig von der Beteiligung verschiedener Stressfaktoren und Lagerzeiten zu unterscheiden. Die Klassifizierung ergab Genauigkeiten von 97,6 % (Raman) bzw. 96,6 % (Infrarot) und es wurde ein robustes und aussagekräftiges Modell zur Unterscheidung verschiedener Mikroorganismen auf Gattungs-, Arten- und Stammebene entwickelt. Die erzielten Ergebnisse sind sehr vielversprechend und zeigen, dass die entwickelten Methoden und Modelle zur Unterscheidung von Mikroorganismen sowie zur Untersuchung von Stressfaktoren auf Mikroorganismen mittels Raman- und IR-Mikrospektroskopie das Potenzial haben, beispielsweise im Lebensmittelbereich zur schnellen Bestimmung von Oberflächenkontaminationen eingesetzt zu werden.